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western blot 常見問題及解決辦法
點擊次數:147 發布時間:2019-10-29

     我們在做WB時zui常遇到的問題也是驚人的相似——樣品漂浮、蛋白條帶扭曲(無法準確判斷蛋白分子量)、轉膜后看不到帶藍色或橙色的指示條帶、抗體孵育不均勻導致曝光度差異很大(依然是會影響到蛋白表達量的估算)。

     這些問題其實都或多或少與樣品前處理有關。也就是說,我們完全可以通過優化樣品處理手法,以及經驗累積,來獲得的WB結果。

     1.出現樣品漂浮怎么辦??

     原因分析:樣品中含有未除凈的溶劑或雜質,其密度比電泳緩沖液小

     解決辦法:處理組織或菌體時,需充分分散或裂解,確保目的蛋白盡可能的釋放;
     熱處理粗樣時,確保升溫迅速,并且金屬浴或水溫的實際溫度達到100℃(在海拔較高處水的沸騰不能確保溫度);
     離心的轉速和時間足夠;
     吸取上清液時盡量不要碰到中間層

     2.蛋白條帶出現扭曲怎么辦?

     原因分析:分離膠的濃度與蛋白分子量不對應;灌膠時間過長或過短,導致丙烯酰胺的交聯度不均勻

     解決辦法:根據目的蛋白的分子量選擇正確的分離膠濃度;
制備分離膠與濃縮膠時,應保證緩沖液母液的正確稀釋,以及各組分的充分混勻(僅用移液器吹吸是不夠的,可以迅速用磁力攪拌器進行混勻)

     3.轉膜后沒有指示條帶怎么辦?

     原因分析:如果此時SDS-PAGE膠上也沒有指示劑,則表明轉膜時間過長,蛋白穿膜(此時就沒有再繼續做下去的必要了)

     解決辦法:注意控制轉膜時間;
電泳液反復使用也可能導致轉膜失敗

     4.抗體孵育不均勻怎么辦?

     原因分析:孵育時振蕩搖床轉速過快,或是混勻直徑不夠,導致孵育不充分或不均勻

     解決方法:確保搖床可以在50 rpm穩定運行;選擇振蕩直徑在5~10 mm范圍內的搖床

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